核蛋白酵母双杂交是最经典、应用最广泛的细胞核内蛋白互作验证与文库筛选体系，核心依托 GAL4 转录因子拆分重构机制。GAL4 天然包含两大独立功能结构域：DNA 结合域 BD、转录激活域 AD。
将诱饵蛋白与 BD 融合，猎物蛋白与 AD 融合；
单独存在时 BD 可结合启动子上游 UAS 序列，但缺少 AD 无法启动下游基因转录；AD 游离无靶向结合能力，同样不能激活转录；
若诱饵与猎物蛋白发生特异性相互作用，会把 BD 与 AD 拉近拼接，重构完整 GAL4 转录因子；
复合体结合报告基因启动子，驱动营养筛选标记（His/Leu/Trp）、显色标记（LacZ）表达，酵母可在缺陷筛选平板存活并显色，以此判定两种蛋白存在直接相互作用。
整套反应发生在酵母细胞核内，仅适用于核定位蛋白、胞质可溶性蛋白，无法用于跨膜膜蛋白，这也是它与膜体系酵母双杂交最核心的区别。
二、标准载体与菌株体系1. 常用载体搭配诱饵载体 pGBKT7：携带BD 结构域 + Trp 筛选标记，用于插入 bait 诱饵基因；
猎物载体 pGADT7：携带AD 结构域 + Leu 筛选标记，用于插入 prey 猎物基因或构建 cDNA 文库。
2. 宿主菌株主流选用 AH109、Y2HGold，基因组敲除内源 GAL4，自带多重报告基因，本底低、假阳性少，可实现多轮严谨筛选。
三、完整实验操作流程诱饵载体构建与自激活检测把目标核蛋白基因连入 pGBKT7，转化酵母后涂布缺 Trp 平板；单独培养观察是否能自主激活 His、LacZ 报告基因。若存在自激活，说明诱饵可无猎物蛋白直接启动转录，需要截短蛋白片段或突变关键序列消除本底干扰。
一对一互作验证共转诱饵质粒与单基因猎物质粒，涂布SD-Trp-Leu 双缺平板确认双质粒导入；再转涂 SD-Trp-Leu-His 三缺平板 + X-Gal 显色，能生长且变蓝即为阳性互作。
cDNA 文库大规模筛选将组织 / 细胞文库全部转入携带诱饵的酵母菌株，在高严谨性三缺 / 四缺缺陷培养基上筛选存活单克隆。
阳性克隆鉴定与回交验证提取猎物质粒测序，比对基因信息；将质粒与空载诱饵、无关诱饵分别共转酵母，排除质粒自身激活、非特异结合等假阳性结果。
四、核心技术优势操作成熟、试剂盒体系完善，实验方案标准化，文献引用量最高；
文库库容上限高，可构建千万级大容量 cDNA 文库，适合无预筛选的全局性互作蛋白挖掘；
多重报告基因联动筛选，His 营养筛选 + LacZ 显色双重判定，大幅降低假阳性概率；
专门适配转录因子、染色质结合蛋白、细胞周期调控蛋白等核内功能蛋白，契合转录调控、表观遗传方向研究。
五、明显技术局限只能检测入核蛋白，跨膜蛋白、膜锚定蛋白无法进入细胞核，极易出现假阴性，此类靶标必须选用膜体系酵母双杂交；
蛋白互作发生在酵母细胞核微环境，异源表达可能出现折叠异常，部分蛋白在酵母内无法正确构象结合；
强毒性蛋白、会造成酵母生长抑制的蛋白，难以构建稳定诱饵菌株，筛选成功率大幅下降。
六、与膜体系酵母双杂交核心区别对比项核蛋白酵母双杂交膜体系酵母双杂交信号系统GAL4 转录因子 BD-AD 重构分裂泛素 Nub-Cub 重构反应位置酵母细胞核细胞膜表面适用蛋白核蛋白、胞质可溶性蛋白跨膜蛋白、膜结合蛋白典型载体pGBKT7/pGADT7、pLacZi 单杂交配套pBT3-SUC、pPR3-N 等膜专用载体七、主要应用场景转录因子上下游互作蛋白筛选，解析基因转录调控网络；
表观修饰蛋白、组蛋白结合蛋白互作网络构建；
病毒核蛋白与宿主细胞核内靶蛋白结合机制研究；
配合 pLacZi 酵母单杂交，串联完成DNA - 蛋白 - 蛋白三级调控通路解析。
八、总结